Stadiul si rezultatele obtinute in etapa 1

REZUMATUL ETAPEI

Raportul stiintific si tehnic in extenso este structurat in patru capitole, in care se prezinta activitatile din Planul de realizare, corespunzatoare fiecarui partener.

Activitatea 1.1. Identificarea suplimentelor alimentare si a produselor de uz extern in care vor fi incorporate principiile bioactive. Pregatirea personalului si organizarea specifica a laboratorului pentru realizarea mostrelor experimentale (ROMVAC)

   S-au identificat o serie de principii active care, potrivit compozitiei lor, pot fi folosite ca suplimente nutritive ca tare, prelucrate simplu sau in diferite asocieri.

   Zerul contine o serie de substante cu valori nutritive si/sau bioactive deosebite. Proteinele (α-lactoglobulina, β-lactoglobulina, γ-lactoglobulina, enzimele – lactoperoxidaza, lactoferina si lizozimul) se pot valorifica integral, ca atare sau purifica si asocia cu alte substante stabilizatoare, potentiative sau palatante, sub forma de solutii, pulberi, tablete, ca suplimente nutritive sau ca formule cu aplicatie externe (creme, unguente) pentru actiunile lor hipoglicemiante, antibacterine, antimicotice, antivirale, anticanceroase. Lactoza se poate folosi ca atare, in unele produse alimentare, sau in tehnologii medicinale, sau ca substrat pentru cultivarea unor microorganisme, cu scopul obtinerii de biomasa care reprezinta materia prima pentru pre- si pro-biotice in cadrul unor suplimente nutritive sau pentru a fi folosite in scop medical sau paramedical (diagnostic).

   Produsele stupului sunt de asemenea larg folosite pentru proprietatile lor nutritive (mierea, polenul, laptisorul de matca, pastura), bioactive (antibacteriene, antimicotice, antiparazitare, antivirale, anticanceroase, imunomodulatoare si imunostimulatoare) si terapeutice (propolisul, capaceala, ceara). Propolisul si polenul se poate valorifica sub forma de extract apos, alcoolic, hidroalcoolic sau in diferite substante chimice (polietilen glicol), la diferite greutati moleculare (in special, PEG – 200, PEG – 400). Capaceala, compusa in principiu din miere, ceara, propolis, enzime si substante naturale cu rol antibiotic, va fi conditionata prin combinatii adecvate pentru realizarea unui produs nutritiv standardizabil sau, extragerea principiilor bioactive si utilizarea lor in formule de suplimente nutritive sau produse medicamentoase. Ceara are in compozitie policosanol eficient ca agent de scadere a colesterolului din sange, avand o actiune benefica asupra sistemului cardiovascular. S-a demonstrat de asemenea activitatea antibacteriana, bacteriostatica si antimicotica a cerii si derivatelor sale. Mierea de albine va fi deshidratata pentru a facilita utilizarea ei in forme medicamentoase (pulberi, granule, drajeuri, tablete, etc), ca atare dar si in combinatie cu alte substante nutritive, energizante sau medicamentoase.

   Membranele cochiliere si cojile de ou purificate si derivatizate, ar putea fi folosite ca atare sau in combinatii cu diferite produse ale stupului sau ale zerului in forme medicamentoase (tablete, solutii, picaturi).

   In ceea ce priveste pregatirea personalului si organizarea specifica a laboratorului pentru realizarea mostrelor experimentale s-a intocmit o fisa generala de cercetare pentru echipele ROMVAC, fise specifice fiecarei activitati si s-a realizat instruirea cercetatorilor implicati. Organizarea laboratoarelor s-a facut pornind de la sarcinile care ii revin fiecarei eechipe, s-au identificat aparatura, instalatiile, materiile prime. Materialele necesare, dupa caz, s-au cumparat din fondurile temei si/sau ale companiei (exemple: filtre ceramice, combina microscop – linie captare imagini, calculator).

   Activitatea 1.2. Elaborarea modelului experimental de separare a membranei cochiliere de coaja de ou (ICECHIM)

   Valorificarea superioara a cojilor de oua rezultate ca produse secundare ale industriei alimentare si ale industriei de procesare a oualor consta in obtinerea de compusi cu valoare adaugata cu aplicatii in domeniul biomedical, farmaceutic, cosmetic, alimentar.

   Coaja de ou reprezinta 10-12% din masa acestuia si este formata din carbonat de calciu, carbonat de magneziu, fosfat de calciu si substanta organica, organizate pe doua straturi suprapuse, unul palisadic format din coloane aproape paralele si unul mamilar conic, cu terminatii rotunjite, cu care se ataseaza de matricea de colagen a membranei cochiliere.

   Membrana cochiliera este formata dintr-un strat extern usor mineralizat, care captuseste interiorul cojii si unul intern nemineralizat, care acopera albusul, ambele prezentand o retea fibroasa de colagen de tip I, V si X, osteopontin si sialoproteine, cu rol in formarea cojii.

   Cantitatea de proteine prezente atat in coaja cat si in membrana este > 500, fiind de 4-5 ori mai mare decat in albus (148 proteine) si in galbenus (316).

   Cojile si membranele de oua sunt bogate in multi compusi bioactivi cu valoare biologica si economica ridicata. Separarea completa a membranelor si a cojilor creste valoarea produselor rezultate si se poate realiza prin mai multe metode.

   Desprinderea manuala a membranelor este cel mai simplu procedeu, dar ineficient pentru ca dureaza mult, iar randamentul este scazut. Membranele detasate se usuca in etuva la 300C, se macina si se pastreaza in congelator sau se trateaza cu solutie diluata de 0,5M HCl/L, pentru inlaturarea fragmentelor de coaja ramase si apoi se neutralizeaza cu o solutie de 0,1M NaOH/L.

   Tratamentele cu acizi diluati dizolva carbonatul de calciu al cochiliei, membranele se recupereaza, se spala cu apa deionizata si se usuca la temperatura camerei sau in etuva la 300C -500C.

   Acidul acetic se utilizeaza cel mai frecvent, in diferite concentratii: 100% %, la temperatura de 40C, timp de 18 ore, spalare cu apa deionizata si pastrare la 40C intr-o solutie tampon de fosfat de potasiu (5 mM, pH 7); 4%, timp de 12 ore la 40C, si uscare la 500C, timp de 4 ore.

   Solutia de EDTA 5% s-a utilizat intr-un echipament de separare in care s-au introdus cojile de oua si s-au amestecat la viteza de 50 rpm, timp de 30 minute, membranele usoare fiind colectate cu o sita. O alta metoda de separare utilizand coji de oua imersate intr-o solutie de 100 mM EDTA, la pH=8,5 timp de doua ore, a urmarit reducerea impactului asupra proteinelor. Cojile uscate se strivesc, se trec prin sita de 200 mesh, se amesteca cu apa in raport 1:10 si se agita 15 minute la 600 rpm. Membranele se aduna in stratul superior, iar cojile sub forma de pudra in stratul inferior.

   O modificare a unui procedeu comercial de separare a membranelor consta in spalarea oualor recoltate in apa rece (150C -180C) continand 200 ppm sare de sodiu a acidului hipocloros (hipoclorit de sodiu), clatire cu apa deionizata sterila, golirea continutului, spalarea cojilor cu apa distilata deionizata, macinarea intru-un procesor alimentar continand 400 mL apa sterila si lasarea in repaus pentru depunerea  fragmentelor de coji. Stratul superior al suspensiei apoase care contine fragmente de membrane se decanteaza.

   Separarea cu ajutorul acizilor este o tehnica eficienta, dar sunt putine informatii privind efectul acizilor asupra membranelor si a proprietatilor lor ca biomaterial. Separarea membranelor utilizand tratamente cu acid acetic sau hipoclorit este neagresiva si permite extractia ulterioara a proteinelor. Tratamentul cu hipoclorit de sodiu este o metoda preferata deoarece nu elimina fractia de calcit, iar randamentul proteinelor este mai mare.

   Separarea prin flotatie cu aer dizolvat este o metoda dezvoltata recent, care se desfasoara intr-o instalatie cu apa sub presiune saturata cu aer dizolvat, pompata intr-un bazin de flotatie. Bulele microscopice de aer antreneaza materiile in suspensie, spre suprafata de flotare, unde vor forma o masa compacta. Procesul dureaza doua ore si permite recuperarea a 96% dintre membrane si 99% din carbonatul de calciu prezent.

   Separarea prin tratare cu microunde se bazeaza pe faptul ca membranele au un continut mai mare de apa decat cojile si absorb mai multa energie din undele electromagnetice, ceea ce duce la o incalzire diferentiata a celor doua componente urmata de expansiunea membranelor, slabirea legaturilor fizice dintre coji si membrane si separarea lor.

   Metodele mecanice constau in reducerea dimensiunii cojilor de oua cu ajutorul unui set de cutite fine, trecerea fragmentelor intr-un rezervor cu apa unde sunt lasate sa se depuna si unde sufera forte turbulente in lichid care determina separarea completa a membranelor de fragmentele de coaja. Particulele de membrane fiind foarte usoare raman suspendate in lichid si sunt sifonate sau deshidratate.

   O alta tehnica de separare consta in trecerea fragmentelor de coji de oua printr-o serie de burghie in mediu apos incalzit cu aburi, separarea avand loc intr-un ciclon. Acest procedeu este utilizat comercial.

   Activitatea 1.3 Elaborarea modelului experimental de separare si fractionare a principiilor bioactive din zer si din produsele apicole, conservarea prin liofilizare sau atomizare a acestora (ROMVAC)

   In ceea ce priveste zerul, scopul acestei activitati se refera la purificarea primara a principiilor active din zer (lactoza si proteinele) si incercarea de separare a diferitelor clase de proteine, conservarea acestora in special prin liofilizare, urmate de cercetari analitice privind unele proprietati fizico-chimice si preparative ale celor doua grupe de componente – compozitia cu greutatea moleculara sub 10.000 kDa si pachetul de proteine cu greutati moleculare cuprinse intre 10 -1000 kDa.

   Metodologia aplicata pentru purificarea zerului si extragerea principiilor active parcurge cateva etape importante: Purificarea zerului brut prin filtrare la bateria de filtre ceramice (3 unitati) prin filtru grosier de 8 µm, filtru clarifiant de 4 µm si sterilizant de 0,22 µm; Concentrarea proteinelor rezultate din sarjele de 10 – 100 l de zer la 1-2 l.

   Conservarea derivatelor din zer s-a realizat prin refrigerare (4-8°C), congelare (- 18 /-20°C) si prin liofilizare.

   Modelul experimental de separare si fractionare a principiilor bioactive din zerul integral, centrifugat si concentratul proteic s-a realizat prin electroforeza in gel de poliacrilamida in sistem denaturant (SDS-PAGE). Structurile electroforetice rezultate au fost analizate si s-a procedat la incadrare fractiilor proteice pe baza studiilor  comparative cu datele de literatura. Fractiilr proteice determinate au fost: α- lactoalbumina, β-lactoglobulina, K-cazeina, β-cazeina, α-cazeina, albumina serica, lactoferina, alte proteine.

   S-au realizat studii privind utilizarea zerului deproteinizat cu adaos de peptone, la cultivarea unor bacterii si drojdii. Solutia respectiva s-a demonstrart ca reprezinta o baza buna pentru configurarea unor medii de cultura pentru bacterii cu adaos de peptone in cantitatide 5-6 ori mai mici decat in mediile clasice, reusindu-ae cultivarea eficienta (titruri de peste 1010 UFC) comparativ cu sistemele clasice de cultivare cu titruri egale sau superioare peste 109-1010, in cazul unor tulpini cum ar fi: Enterococcus faecium NCIMB 11181, TL1/2015; Lactobacillus plantarum NCIMB 11974, TL1.

   Studiile privind activitatea antibacteriana a fractiilor proteice din zer au evidentiat activitatea bactericida a derivatelor proteice cu greutatea moleculara cuprinsa intre 10- 100 kDa asupra unor bacterii de interes. Activitatea cea mai puternica a fost observata asupra culturilor de Bacillus antracis, zerurile respective provenind de la animale imunizate contra antraxului.

   In ceea ce priveste produsele stupului, modelele experimentale au avut ca scop extragerea unor principii active din propolis si capaceala prin metode mai eficiente, rapide si necontaminante pentru produsul final precum si identificarea si testarea unora dintre ele, privind compatibilitatea cu unele sisteme biologice – linii celulare, oua embrionate, animale de experienta etc, precum si referitor la activitatile antivirale, antibacteriene, antifungice, citotoxice etc. Propolisul si capaceala au fost analizate prin HPLC.

   Extractia principiilor active din propolis si capaceala a constat in extractia hidroalcoolica, extractia in polietileglicol si extractele apoase.

   Screening microbiologic privind efectele unor extracte din propolis si capacela asupra unor microorganisme s-a realizat pe cateva tulpini reprezentative de bacterii (Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633), levuri (Candida albicans ATCC 10231) si fungi filamentosi (Aspergillus brasiliensis ATCC 16404)

   Extractele de propolis si capaceala au fost testate si pe embrioni SPF si asupra virusului NDV La Sota.

   Activitatea 1.4. Analiza fizico-chimica a cojii de ou, a membranei cochiliere, a principiilor bioactive din zer si a unor produse apicole de interes (ICECHIM)

   Se prezinta metodele de analiza fizico-chimica utilizate pentru caracterizarea cojilor de oua, a membranei cochiliere, a principiilor bioactive din zer si a unor produse apicole (polen, propolis, laptisor de matca), si anume: determinarea continutului de apa, total solide si cenusa prin metoda termobalantei, determinarea azotului total prin titrare  cu solutie standard 0,1 mol/L hidroxid de sodiu, determinarea azotului amoniacal prin titrare cu solutie standard 0,1 mol/L hidroxid de sodiu, determinarea proteinelor totale prin cuantificarea continutului de azot total organic prin metoda Kjeldahl, cuantificarea microelementelor prin metoda ICP-OES, determinarea continutului de acid lactic prin titrare cu solutie de hidroxid de sodiu 0.1N, determinarea lactozei prin metoda gravimetrica Munson-Walker, cuantificarea vitaminelor prin metoda HPLC, identificarea flavonoidelor si a acizilor polifenolici prin LC-MS/MS.

   Analiza fizico-chimica a membranelor cojilor de oua de gaina a evidentiat ca si component majoritar proteinele, care se regasesc in procent de 60,9%. Pentru analiza compozitiei in aminoacizi, proba de membrane se hidrolizeaza enzimatic utilizand enzima Alcalaza 2,4 L si se caracterizeaza cromatografic folosind cromatograful de lichide/spectrometrie de masa cu ionizare prin electrospray (LC/ESI-MS), cuplat cu timp de zbor (time-of-flight-TOF).

   Analiza fizico-chimica a cojilor de oua spalate, uscate si macinate a evidentiat un continut de 97% carbonat de calciu, 1,18% carbonat de magneziu, 0,65% fosfat de calciu, restul componentelor fiind reprezentat prin matricea organica. Concentratiile de CaCO3, MgCO3 si Ca3(PO4) 2 au fost calculate stoiechiometric in functie de concentratiile de Ca, Mg si P determinate in proba.

   Analiza fizico-chimica a zerului dulce a evidentiat proprietatile organoleptice (lichid opalescent cu consistenta fluida, culoare galbuie cu nuanta usor verzuie, uniforma si gust placut, dulceag-acrisor specific fermentatiei lactice) si compozitia chimica. Principala componenta a zerului dulce este lactoza, regasindu-se in cantitate de 4,46 % w/w. Proteinele totale reprezinta doar 0,73% w/w, iar sarurile minerale sunt in cantitati mari, in special potasiu (1000 mg/kg), sodiu (893 mg/kg) si calciu (503 mg/kg).

   Analiza calitativa a compozitiei in aminoacizi s-a realizat prin cromatografie in strat subtire, folosind ca developant n-butanol:acid acetic:apa (50:30:20) si 0,4% ninhidrina. In solutia proba analizata s-au identificat urmatorii aminoacizi: aminoacizi continand sulf (metionina, cisteina) fenilalanina, triptofan, tirozina, alanina, serina, glicina, prolina, histidina, arginina, lizina, precum si aminoacizi esentiali cu lanturi ramificate (leucina si valina)

   Cuantificarea vitaminelor s-a facut prin metoda RP-HPLC si a evidentiat prezenta vitaminelor C (ascorbic acid) si B5 (acid pantotenic, sare de calciu).

   Analiza fizico-chimica a propolisului. Propolisul este o substanta rasinoasa lipicioasa, colectata de albinele lucratoare de pe arbori si amestecata cu saliva lor. In compozitia chimica, variabila in functie de diversitatea geografica a surselor de plante, sezon, speciile de albine, au fost identificati peste 300 de compusi, dintre care predomina flavonoidele, fenolii si compusii aromatici, alaturi de care se gasesc uleiuri volatile, terpene, esteri.

   Pentru identificarea unor flavonoide si acizi polifenolici dintr-o proba de propolis brut s-a preparat un extract in metanol, care a fost analizat prin LC-MS/MS. Pe baza curbelor de calibrare pentru standarde si a dilutiilor efectuate s-au evidentiat urmatoarele clase de compusi: Flavonoli: quercetin; Flavanone: galangin, pinocembrin; Terpenoide: apigenin; Acizi polifenolici: acid cafeic, acid clorogenic, acid p-cumaric, acid benzoic, acid salicilic, acid vanillic. Fragmentele majoritare sunt reprezentate prin galangin (197), acid clorogenic (191), acid cafeic (135), quercetin (121), acid p-cumaric (119), apigenin (116,6) si pinocembrin (107).

   Analiza fizico-chimica a polenului. Polenul, sub forma de grauncioare de 2,5-250 µm, este recoltat de albine de pe anterele florilor, amestecat cu cantitati mici de saliva sau nectar si depus in celulele fagurelui. Polenul contine peste 200 de compusi chimici: proteine, aminoacizi esentiali, carbohidrati digerabili, lipide, vitamine si minerale.

    Probe de polen granule au fost analizate pentru determinarea continutului in vitamine si minerale. Pentru analiza continutului de vitamine, polenul granule a fost solubilizat prin ultrasonare in apa ultrapura si dizolvare in solutie de TFA 0.01%. S-a detectat prezenta acidului ascorbic (vitamina C), tiaminei (vitamina B1), riboflavinei (vitamina B2) si piridoxinei (vitamina B6). Prezenta vitaminelor a fost confirmata prin analizarea polenului concentrat in aceste vitamine. In ceea ce priveste continutul in minerale, predomina K (0,67 % w/w) si P (0,51 % w/w).

   Analiza fizico-chimica a laptisorului de matca, substanta alba, vascoasa, de consistenta unui jeleu, produsa de glandele hipofaringeale si mandibulare ale albinelor lucratoare, a urmarit identificarea vitaminelor. Laptisorul de matca a fost dizolvat in apa ultrapura si apoi in solutie TFA 0.01% vol si injectata in HPLC. In urma compararii cu spectrul solutiei de standarde s-a determinat prezenta a 3 vitamine: acidul ascorbic (vitamina C), tiamina (vitamina B1) si piridoxina (vitamina B6). Pentru confirmare s-a injectat si o solutie de laptisor de matca concentrata in vitaminele de interes.

Optimized with PageSpeed Ninja