Stadiul si rezultatele obtinute in etapa 2

 

 

Raportul stiintific si tehnic in extenso este structurat in patru capitole, in care se prezinta activitatile din Planul de realizare, corespunzatoare fiecarui partener.

Activitatea 2.1 – Realizarea modelului experimental de obtinere si fractionare a principiilor bioactive din zer si din unele produse apicole si conservarea acestora prin refrigerare/ congelare/ liofilizare / atomizare, dupa caz (CO-ROMVAC)

Zerul este un subprodus rezultat din fabricarea branzeturilor, ca urmare a coagularii cu cheag prin acidifiere naturala, obtinut al fabricarii cazeinei si a coprecipitatelor proteice. Valorificarea zerului prin procedee conventionale se realizeaza indeosebi pentru obtinerea unor produse destinate alimentatiei umane. In zer se gasesc intr-o proportie mai mare decat in lapte, proteine solubile, substante minerale si minerale hidrosolubile. Zerul este o excelenta sursa si de vitamine si lactoza. Proteinele din zer constau din α-lactalbumina, β- lactoglobulina, albumina serica, imunoglobuline si proteoza-peptone. Proteinele din zer contin cea mai mare concentratie de aminoacizi. Productia de anticorpi se realizeaza numai sub actiunea aminoacizilor, unul dintre cei mai importanti fiind cisteina.

Evacuarea in mediul inconjurator pune serioase probleme de poluare, accentuate de faptul ca un litru de zer are un consum biochimic de oxigen (CBO) de 50.000 mg/litru. Cea mai rationala si profitabila forma de valorificare a zerului este indrumarea sa catre alimentatia umana si catre furajare, deziterat caruia isi propune sa raspunda si activitatea noastra din prezentul proiect. Exista o gama larga de produse si subproduse ale stupului care pot fi valorificate in cadrul unor formule de suplimente nutritive, formule medicamentoase sau cosmetice, ca atare sau in asociere cu derivate din diferite alte baze, in cazul nostru, din zer si membrane cochiliere.

Propolisul, polenul, capaceala, ceara, mierea-produse ale stupului-sunt bine cunoscute in medicina traditionala, iar utilizarile si aplicatiile lor s-au extins din aria alimentelor sanatoase la cea medicala si farmaceutica. Prezenta cercetare a plecat de la beneficiile produselor apicole, avand ca rezultat studiul extractelor de propolis, capaceala, polen in scopul folosirii lor ca materii prime pentru formularea de preparate farmaceutice. Extractele obtinute s-au caracterizat prin analize microbiologice, spectrofotometrice, cromatografice si fizico-chimice si s-au utilizat ca materii prime in formulari farmaceutice, precum pasta de dinti, apa de gura, crema, supozitoare, sirop, jeleuri s.a., tinandu-se cont de proprietatile biomedicale pe care le poseda (efect antimicrobian, antioxidant, cicatrizant si imunomodulator).

Modelele experimentale privind obtinerea si conservarea unor principii active din zer pe de o parte si unele produse apicole pe de alta parte, au stat la baza intocmirii si dezvoltarii unor programe de cercetare (fise de cercetare) derivate din desfasuratorul de activitati al prezentului contract. Programul a fost defalcat pe subactivitati specifice pentru fiecare directie, echipele respective intocmind de asemenea fise de cercetare subsidiare, cu scopul obtinerii, purificarii caracterizarii si configurarii unor precursori pentru procesele   tehnologice, care s-au dezvoltat in capitolul 2.4. Ne referim la proteine, solutii si medii cu glucide, saruri minerale, aminoacizi, enzime, structuri mai elaborate, cum ar fi chitosanul si policosanolul (inca nefinalizate) precum si culturi de microorganisme (Kluyveromyces, Lactobacillus, Enteroccus) care urmeaza sa fie introduse in formule de suplimente nutritice  cu probiotice. Modelele experimentale au cuprins si o serie de tehnici de control, analiza si caracterizare a derivatelor respective.

Activitatea 2.2 – Realizarea modelelor experimentale de separare a membranei cochilere de coaja de ou (P1- ICECHIM)

Cojile de oua si membranele, considerate deseuri, sunt o resursa regenerabila de compusi bioactivi cu valoare economica, si care se pot extrage dupa separarea eficienta a membranelor de cojile de oua. Se cunosc numeroase intrebuintari ale cojilor de oua si ale membranelor detasate, dar putine pentru cojile integrale. Separarea membranelor este dificila si limiteaza valoarea deseurilor de oua, din cauza interactiunii cristalelor de carbonat de calciu cu matricea organica. In aceasta etapa s-au realizat mai multe modele experimentale de separare.

Cel mai simplu procedeu consta in desprinderea manuala a membranelor de pe coajile de oua. De la 1 ou de dimensiuni medii se obtin cca. 4,9 g coaja si 0,13g membrane. Membranele detasate se spala cu apa distilata, se usuca in etuva la 300C timp de 30 minute, apoi se macina si se pastreaza in congelator. Acest procedeu este usor, se foloseste cel mai mult la nivel de laborator, dar este ineficient si dureaza mult.

Tratamentul cu acizi diluati (acid acetic/acid clorhidric/EDTA/acid sulfuric) dizolva carbonatul de calciu al cochiliei si separa membranele, care se pot recupera. S-au efectuat tratamente cu acid acetic glacial 50%, randamentul separarii fiind de 60,8% si cu EDTA tetrasodic, in doua variante experimentale, singur si in amestec cu acid acetic glacial 8%. Randamentul separarii a fost de 44,3%. Pentru recoltarea membranelor detasate s-au folosit doua metode: NaCl si suflanta cu aer.

Se prezinta fluxul tehnologic de obtinere a membranelor cochiliere.

Separarea membranelor prin tratare cu ultrasunete s-a realizat in trei variante folosind o baie ultrasonica la 35kHz. Separarea membranelor prin acest procedeu nu duce la obtinerea celor doua componente.

Dintre metodele experimentate de separare a membranelor, tratamentul cu acizi  diluati este un procedeu non-agresiv, care permite extractia ulterioara a proteinelor. S-a constatat ca reducerea dimensiunii particulelor de coji de oua diminueaza eficienta procesului de separare.

Activitatea 2.3 – Obtinerea experimentala a Ca organic din coaja de ou si a membranelor cochilere hidrolizate si conservarea acestora prin metode adecvate (uscare-liofilizare /atomizare / refrigerare, congelare) (P1-ICECHIM)

Obtinerea experimentala a Ca organic din coaja de ou

Calciul este un mineral esential, necesar pentru mentinerea echilibrului electrolitic in organism si pentru functionarea adecvata a numeroase mecanisme de reglare. In general, se considera ca bioaccesibilitatea calciului este influentata de pH-ul din stomac, unde are loc ionizarea lui, ceea ce asigura o buna absorbtie la nivel intestinal.

Cele mai comune forme de suplimente alimentare de calciu sunt carbonatul de calciu (CaCO3), cu cea mai mare concentratie de calciu elemental (40%) si citratul de calciu [(Ca3(C6H5O7)2], al carui continut in calciu este de 21%

Au fost realizate modelele experimentale de obtinere a carbonatului de calciu si a citratului de calciu, sarurile cele mai utilizate ca suplimente si aditivi alimentari.

Pentru obtinerea CaCOcojile de oua se pretrateaza prin spalare cu apa de robinet, iar dupa separarea membranelor se spala cu apa distilata, se fierb 20 de minute pentru   distrugerea microrganismelor patogene, se usuca in etuva, la 1200C, timp de 2 ore si se macina. Pentru purificarea produsului, peste pulbere se adauga apa distilata rece si se lasa in repaus timp de o ora, dupa care se usuca in etuva la 1050C, pana la greutate constanta.

Citratul de calciu s-a obtinut prin doua metode: a. prin inlocuire; b. prin reactia dintre acidul citric si carbonatul de calciu.

  • a.   CaCOdin cojile de oua se dizolva cu acid acetic, obtinandu-se acetatul de calciu, peste care se adauga acid citric, care induce o reactie de inlocuire in urma careia se obtine citratul de calciu cu puritate mare. Ecuatia reactiei este urmatoarea:

CaCO(din pulbere de coaja de ou) + acid organic → calciu organic + H2O + CO

Calciu organic + 2C6H8O7·4H2O (acid citric) →Ca(C6H5O7)2·4H2O (citrat de calciu tetrahidrat) ↓ + acid organic

In urma aplicarii acestei metode s-a obtinut un randament de citrat de calciu brut de 53,6%. Pentru purificare, citratul de calciu brut se dizolva in acid citric in concentratie de 0,0070 mol/L, se agita cateva minute la temperatura de 1000C si solutia se filtreaza pentru indepartarea impuritatilor.

  1. S-a realizat obtinerea citratului de calciu utilizand metoda traditionala, care are la baza reactia dintre acidul citric si carbonatul de calciu, conform reactiei

2C6H8O+ 3CaCO→ Ca3(C6H5O7)+ 3H2O + 3CO2

Amestecul de pulbere de coji de oua si solutia de acid citric 6% se lasa in rapaus sa reactioneze 2-3 zile, la temperatura camerei. Randamentul de citrat de calciu brut este de 30,80%. Se constata ca nu toata cantitatea de coji s-a dizolvat in solutia de acid citric, iar o cantitate mica de citrat de calciu insolubil a ramas in faza apoasa. In urma unor studii efectuate s-a stabilit ca solubilitatea carbonatului de calciu creste prin marirea concentratiei  de acid citric.

Conservarea carbonatului de calciu si a citratului de calciu se face prin uscare.

Obtinerea experimentala a membranelor cochilere hidrolizate

Membranele cojilor de oua au ca si compus principal proteinele, care pe langa valoarea lor nutritionala, au si un rol esential in procesele fiziologice ale organismului, rol pe care si-l exercita in urma hidrolizei partiale, in scopul producerii de peptide bioactive.

Hidroliza proteinelor se poate realiza cu enzime (Alcalaza 2,4L, Viscozyme L, Proteaza), cu baze tari (NaOH) sau cu acizi.

Pentru hidroliza enzimatica, amestecul de coji de oua cu membrane se suspenda in apa distilata in raport 1:30 g/mL si se trateaza ultrasonic. Dupa ajustarea pH-ului la 8,5 proba se preincubeaza la temperatura de 550C, 15 minute, dupa care se porneste reactia de hidroliza prin adaugarea a 1,5 mL enzima, timp de opt ore. Se obtin 0,017g precipitat proteic.

Hidroliza alcalina a proteinelor se realizeaza sub actiunea bazelor tari, la cald, rezultand ruperea legaturilor peptidice pana la aminoacizi si peptide. Proba de coji de oua cu membrane se suspenda in solutie NaOH 5%, si se incubeaza 24 ore, la 370C. Supernatantul obtinut in urma centrifugarii se ultrasoneaza. Se ajusteaza pH-ul la 8,5 cu HCl concentrat. Pentru inlaturarea NaCl format in solutia de proteine solubile din membrane, supernatantul se dializeaza fata de apa distilata timp de 24 ore. Se obtin 0,72g de precipitat proteic.

Intr-o alta varianta experimentala hidroliza alcalina a fost urmata de hidroliza enzimatica, obtinandu-se 0,46 g precipitat proteic.

Precipitarea proteinelor, pentru cele trei metode experimentate, s-a realizat prin scaderea pH-ului pana la atingerea punctului izoelectric la pH intre 3,5-4. Procentul de proteina solubilizata se calculeaza prin determinarea cantitatii de azot din proba si din membrane prin metoda Kjeldahl.

Dintre metodele utilizate pentru obtinerea hidrolizatelor proteice din cojile de oua cu membrane nedetasate, cea mai eficienta este hidroliza alcalina. Tratamentul cu ultrasunete favorizeaza desprinderea fragmentelor de proteine.

Conservarea probelor se face prin uscare-liofilizare.

Caracterizarea fizico-chimica a hidrolizatelor proteice

Dupa obtinerea membranelor cochiliere hidrolizate, se preleveaza probe de 20 mL, care se analizeaza din punct de vedere fizico-chimic. Natura proteica a fost demonstrata prin fluorescenta si spectroscopie FT-IR, atat la proba inainte de procesare cat si la proba  in timpul procesarii.

Pentru determinarea oligopeptidelor obtinute in urma hidrolizei alcaline a membranelor cochiliere se utilizeaza cromatografia de lichide de faza inversata cu spectrometrie de masa.

Pentru studiul aminoacizilor liberi prezenti s-a procedat la cromatografia de lichide de tip HILIC (hydrophilic interaction liquid chromatography), un tip de croamtografie de faza inversata cu coloana proprie fazei normale. Au fost pusi in evidenta aminoacizi hidrofobi (prolina, valina, hidroxiprolina, leucina+izoleucina, fenilalanina, triptofan) cunoscuti pentru activitate antioxidanta.

Caracterizarea hidrolizatelor proteice pe baza greutatilor moleculare s-a realizat prin analiza electroforetica SDS-PAGE (sodium dodecil sulfat poliacrilamida gel), in cadrul laboratorului de analize al partenerului coordonator al proiectului –ROMVAC-.

In urma efectuarii testului SDS PAGE pentru cele trei probe se identifica fractiuni proteice cuprinse intre ̴ 14.45kDasi ̴ 70.60kDa.

Act 2.4 – Realizarea tehnologiilor de obtinere asuplimentelor alimentare pe baza de principiibioactive din zer si produse apicole, realizate sub unasau mai multe dintre urmatoarele forme deconditionare: bauturi, pulberi, pulberi hidrosolubile,efervescente, tablete, capsule, batoane.Realizarea tehnologiilor de obtinera produselor pebaza de principii bioactive, de uz extern, preparatesub una dintre formele de conditionare creme, geluri, lotiuni (CO-ROMVAC)

Tehnologiile de obtinere a suplimentelor alimentare si cosmeticelor se bazeaza pe un flux operational care cuprinde identificarea surselor de principii active (zer, ou, stup), extragerea substantelor de interes cum s-a prezentat in capitolul anterior – 2.1., analiza si testarea acestora-preformulare, realizarea unor formule de produse prin amestecuri, conditionare sub forma de solutii, geluri, creme etc, deshidratarea prin procedee moderne, cum ar fi liofilizarea, formarea unor amestecuri omogene cu pulberile rezultate, tabletare, ambalare finala si control specific final.

In urma activitatii desfasurate, diferitele echipe din cadrul companiei ROMVAC au obtinut o serie de preparate cum ar fi vehiculele bioactive-conditionate prin deshidratare controlata-liofilizare: Organicbioactiv-baza 1 – amestec format din retentat de zermierepolenextract de capaceala in PEG 400 (S1)extract de propolis in PEG 400 (S1) si amidon  in solutie-suspensie, Organicbioactiv-baza 2 – amestec format din miereextract de capaceala in PEG 400 (S1)extract de propolis in PEG 400 (S1)amidon in solutie-suspensie si dioxid de siliciu, Organicbioactiv-baza 3 – amestec format din retentat de zer 10 kDamierepolenextract de capaceala in PEG 400 (S1)extract de propolis in PEG 400 (S1), amidon in solutie- suspensie si dioxid de siliciu, Organicbioactiv-baza 4 – amestec format din retentat de zer 5kDamierepolenextract de capaceala in PEG 400 (S1)extract de propolis in PEG 400 (S1), amidon in solutie-suspensie si dioxid de siliciu.

Suplimente nutritive, cosmetice sau produse medicamentoase, ca: Organicbioactiv ROMBIOTIC 3 – Pulberea liofilizata Baza 4, in care s-au integrat pulberi liofilizate cu Kluyveromyces marxianus, Lacobacillus plantarum, Enterococcus faecium, concentrat de zer liofilizat, plus adaosuri specifice necesare tabletarii, Organicbioactiv ORALTRAT – solutie aspersabila cu aplicare orala formata din propolis, capaceala si uleiuri volatile – uleiul de pin si uleiul de salvie, Organicbioactiv – MELIFIVE-cream – amestec dupa o formula specifica cu alte elemente – colagen, ceara de albine purificata in cadrul proiectului, viatamine, uleiuri volatile, extracte vegetale, emulgatori etc, Organicbioactiv – OROCLEAN Apa de gura A, Ceara de albine purificata, precum si o serie intreaga de preparate realizate din propolis si polen, cu mentiunea ca, acestea vor reprezenta si vehicule pentru principii bioactive obtinute din zer si ou, la prezentul proiect de cercetare: Pasta de dinti cu extract apos de propolis si polen – Organicbioactiv – DENTIPROP, Apa de gura cu extract apos de propolis si polen– Organicbioactiv – DENTIPROP AQUA, Supozitoare cu propolis– Organicbioactiv – PROPOCOL cu propolis, Supozitoare cu polen – Organicbioactiv – PROPOCOL cu polen, Crema cu propolis – Organicbioactiv – PROPOCREAM cu propolis, Crema cu polen– Organicbioactiv – PROPOCREAM cu polen, Sirop cu propolis si polen– Organicbioactiv – SIRUPROP, Jeleuri cu propolis si polen – Organicbioactiv – PROPOJELLY.

Avand o compozitie complexa in proteine, bioflavonoide, minerale, vitamine, enzime, aminoacizi si oligoelemente, aceste ingrediente naturale provenite din cele trei gruope de materiale (zer, ou, apicole) poseda proprietati remarcabile si benefice pentru organismul uman. Formulate in diferite preparate pentru utilizare ca suplimente nutritive cat si ca administrare topica si sistemica pot completa alimentatia si ajuta la prevenirea, tratamentul si ameliorarea unor afectiuni cu diverse etiologii.

Fiecare produs rezultat prezinta proprietati si actiuni specifice, combinatia lor in diferite preparate farmaceutice conduce la un sinergism de potentare a unor efecte benefice rezultand formule complexe si complete pentru sanatatea organismelor.